GLP-1(linkki:https://www.bloomtechz.com/synteettinen-kemiallinen/peptidi/glp-1-peptidi-cas-87805-34-3}.html) on polypeptidihormoni, joka koostuu 30 aminohaposta. GLP:n-1 perusteellisen tutkimuksen myötä synteettisiä menetelmiä on kehitetty yhä enemmän. Tässä artikkelissa esitellään järjestelmällisesti tällä hetkellä tunnetut GLP:n-1 synteesimenetelmät.
Menetelmä 1, kiinteäfaasisynteesi:
Kiinteäfaasisynteesi on laajalti käytetty menetelmä peptidien ja proteiinien synteesiin, ja sitä käytetään myös yleisesti GLP:n-1 synteesiin. Kiinteäfaasisynteesissä ydinrakenne muodostetaan liittämällä ensimmäinen aminohappo hartsiin. Seuraavaksi seuraava aminohappo lisätään järjestyksessä ja saatetaan kemiallisesti reagoimaan sopivan kondensointiaineen kanssa. Lopuksi kohdetuote voidaan saada pilkkomalla polypeptidi hartsista.
Kiinteäfaasisynteesin merkitys on, että se mahdollistaa peptidisynteesin automatisoinnin ja laajamittaisen tuotannon. Nykyisiä valtavirran kiinteäfaasisynteesimenetelmiä ovat Fmoc ja Boc. Niistä Fmoc-menetelmä käyttää N-Fmoc-suojaryhmää suojaamaan peptidiä, kun taas Boc-menetelmä käyttää tert-butyylioksikarbonyyliä suojaamaan karboksyyliryhmää.
Menetelmä kaksi, nestefaasisynteesi:
Nestefaasisynteesi on perinteinen peptidisynteesimenetelmä, jossa reagoivat aineet sijoitetaan nestefaasiin reaktiota varten. Nestefaasisynteesin etuna on, että reaktio-olosuhteet ovat lievät ja sopivat herkkien kemiallisten rakenteiden modifiointiin. Liian monista lähtöaineista johtuen puhdistusprosessi on kuitenkin suhteellisen hankala. Kemiallisia reaktioita nestefaasisynteesissä ovat:
1. Kondensaatioreaktio:
Kondensaatioreaktio on yksi peptidisynteesin perusreaktioista, eli kondensoivien aineiden, kuten DCC:n ja HOBt:n, käynnistämä karboksyyliryhmä kytkeytyy aminohapon aminoryhmään asylointireaktion kautta. Reaktio-olosuhteet ovat lieviä ja saanto korkea.
2. Eliminaatioreaktiot:
Eliminaatioreaktio on pelkistää metioniini ditioliksi NaBH4:n ja muiden pelkistysaineiden avulla, mikä tekee siitä inaktiivisen. Reaktio on suoritettava emäksisissä olosuhteissa.
3. Suojaryhmien poistaminen:
Johtuen aminohappojen erilaisista toiminnoista peptidiketjussa, suojaukseen käytetään erilaisia suojaryhmiä. Kun synteesi on valmis, suojaryhmä on poistettava. Fmoc-menetelmässä piperidiiniä käytetään yleensä poistamaan Fmoc; kun taas Boc-menetelmässä TFA:ta käytetään Boc:n poistamiseen.
Menetelmä kolme, kemiallinen synteesi:
GLP-1 on polypeptidihormoni, jolla on tärkeitä biologisia vaikutuksia. Sen synteesi voidaan toteuttaa eri menetelmillä, joista kemiallinen synteesi on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä. Kemiallisen synteesin etuna on, että sillä voidaan tuottaa erittäin puhtaita kohdetuotteita, jotka soveltuvat laajamittaiseen tuotantoon. Kemiallinen synteesimenetelmä ja GLP{2}}:n yksityiskohtaiset vaiheet esitellään alla.
1. Synteettinen reitti ja suojaryhmän valinta:
GLP{0}}-molekyyli koostuu 36 aminohaposta, mukaan lukien 21 L-tyypin ja 15 D-tyypin aminohappoa. Ennen synteesin suorittamista on tarpeen valita sopiva synteesireitti ja valita vastaava suojaryhmä synteesiolosuhteiden mukaan. Fmoc-kiinteäfaasisynteesiä käytetään yleensä automatisoituun suuren mittakaavan synteesiin. Tämä menetelmä käyttää N-9-fluori-imidokarboksyylisuojausta (N-Fmoc) suojaryhmänä, ja sen on myös valittava sopiva sekundäärinen suojaryhmä (kuten tert-butyyli tai metyyli) tiettyjen kohtien suojauksen varmistamiseksi. Joka kerta kun uusi aminohappo lisätään, Fmoc-suojaryhmä on ensin poistettava ja sitten lisätään seuraavan aminohapon suojattu kytkentäaine.
2. Ydinaminohapposekvenssin synteesi:
GLP{0}}:n ydinsekvenssi koostuu 21 aminohaposta, mukaan lukien avainseriini- ja neljä prolyyliglutamiinihappodipeptidisekvenssiä. Kiinteäfaasisynteesissä ydinsekvenssin synteesi voidaan jakaa seuraaviin vaiheisiin:
2.1. Lisää etikkahappokarbamaattia (Fmoc-NH-CH2CO2Et) ja 2-Cl-Trt-Cl kiinteäfaasiseen synteettiseen hartsiin ja suorita kondensaatioreaktio DIC/NMM-kytkentäaineen kanssa.
2.2. Poista Fmoc-suojaryhmä poistamalla suojaryhmäreaktio.
2.3. Lisää seuraava aminohappo, toista vaiheet 1 ja 2 peräkkäin, kunnes ydinsekvenssi on syntetisoitu.
2.4. Pentapeptidirakenteiden muodostuminen kiinteäfaasihartsille. Lisää asetalisointireagenssi kiinteäfaasihartsiin, reagoi N-pään tunnistusaineen (kuten HBTU) kanssa, lisää seriinin sivuketjun suojaryhmä apupelkistysaineena ja poista sitten Fmoc-suojaryhmä.
2.5. Bacillus subtilis -transferaasin (ProTide) katalyysin alaisena pentapeptidirakenne käy läpi vaihtoreaktion seriinijodiasetaatin esiasteen kanssa.
3. Jäljellä olevan aminohapposekvenssin synteesi:
Kun ydinsekvenssin synteesi on valmis, on tarpeen jatkaa jäljellä olevien aminohappojen lisäämistä, mukaan lukien L- ja D-tyypin aminohapot. Näiden aminohappojen lisääminen on aloitettava ydinsekvenssistä, lisättävä sekvenssin seuraava aminohappo ja käytettävä vastaavaa kondensointiainetta kemiallisten reaktioiden suorittamiseen, kunnes täydellinen GLP-1-polypeptidimolekyyli on syntetisoitu. Tämän prosessin aikana on myös tarpeen valita sopiva suojaryhmä tarpeen mukaan ja suorittaa vaiheet reaktio, suojaryhmän poistaminen ja aminohapon lisääminen järjestyksessä.
4. Natriumhydroksidikäsittely:
Kun kaikki aminohapot on lisätty, epätäydellisesti syntetisoitunut peptidiketju muodostuu kiinteän faasin hartsille, ja se on käsiteltävä täysin muodostuneen peptidimolekyylin muodostamiseksi. Ensinnäkin muodostumaton peptidi tulee hydrolysoida natriumhydroksidilla niin, että hartsiin alun perin kiinnittynyt C-terminaalinen karboksyyliryhmä irtoaa hartsista ja suojaryhmä irtoaa vedessä. Hydrolyysireaktion jälkeen saadaan kohdetuote.
5. Saostus ja pesu:
Käsittelyn jälkeen hydrolysoitua liuosta käsitellään hapolla kohdetuotteen saostamiseksi. Seuraavaksi pelletti suspendoitiin uudelleen veteen, mitä seurasi intensiivinen pesu epäpuhtauksien poistamiseksi.
6. Puhdistus:
Viimeinen vaihe on halutun tuotteen puhdistus, tavallisesti korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa käyttäen. Tämän prosessin aikana tuotteen puhtaus voidaan määrittää havaitsemalla liuoksen huippu massaspektrissä. Lyhyesti sanottuna GLP{0}} kemiallinen synteesi vaatii useita monimutkaisia reaktioita ja tiukkoja puhdistusprosesseja, jotta lopulta saadaan aktiivinen kohdetuote.
Menetelmä neljä, biosynteesi:
GLP-1 on tärkeä polypeptidihormoni, jolla on erilaisia fysiologisia vaikutuksia, mukaan lukien insuliinin erittymisen edistäminen, ruokahalun vähentäminen, painon alentaminen ja insuliiniherkkyyden ylläpitäminen jne. GLP-1:n biosynteesimenetelmä syntetisoidaan pääasiassa L-soluissa. haimarauhasessa, ja sen synteesinopeutta säädellään ravinnosta saatavalla saannilla. Yksityiskohtaiset vaiheet esitellään seuraavasti:
1. Valmistelut ennen synteesiä:
Ennen GLP:n{0}} biosynteesiä on suoritettava valmistelutyötä, mukaan lukien käytetyn solutyypin määrittäminen, viljelyolosuhteiden asettaminen ja sopivan katalyyttisen entsyymin valinta. L-solut ovat pääasiallinen GLP-1-synteesin lähde, koska ne sisältävät kahden hormonin, GIP:n (glukagonin kaltaisen peptidin 1) ja GLP-1:n esiasteita. L-soluja voidaan eristää kanien tai hiiren suoliston epiteelistä. Ennen biosynteesiä soluja on viljeltävä riittävä määrä ja riittävä ravintoaine ja sopivat viljelyolosuhteet tulee tarjota. Lisäksi on tarpeen valita sopiva katalyyttinen entsyymi reaktion edistämiseksi.
2. Esiasteiden synteesi ja käsittely:
GLP{0}} biosynteesi tapahtuu pääasiassa L-soluissa, ja sen esiaste koostuu kahdesta hormonista, GIP:stä ja GLP:stä-1. Kun GIP ja GLP-1 ovat saapuneet endokriinisiin soluihin, ne prosessoidaan proteolyyttisten entsyymien toimesta ja pilkkoutuvat yksittäisiksi peptideiksi. Tässä prosessissa on mukana sarja entsyymejä ja kofaktoreita, mukaan lukien esiastepolypeptidiasidaasi (PC2), isomeraasi ja myöhäiset adheesiotekijät.
3. Keskinäinen muuntaminen polypeptidisegmenttien välillä:
Käsittelyn jälkeen GIP- ja GLP{0}}-peptidit yhdistetään uudelleen GLP-1-polypeptidin muodostamiseksi. Tämä prosessi edellyttää glukagonin kaltaisen peptidin 1 (GLP-1) käyttöä templaattina, johon yhdistetään muita yksittäisiä peptidejä uusien yhdistelmäpolypeptidien muodostamiseksi. Tämä prosessi vaatii myös tiettyjä entsyymejä ja tekijöitä, mukaan lukien prohormonikonvertaasi 1/3 (PC1/3) ja karboksipeptidaasi E (CPE).
4. GLP-1-eritys:
Kun GLP-1 on syntetisoitu ja prosessoitu, se varastoituu endokriinisten solujen sytoplasmaan ja sisäisiin vesikkeleihin. Kun umpierityssolut stimuloivat ruokavaliota, ne vapauttavat GLP:tä-1 ja pääsevät verenkiertoon mikroverisuonten kautta. Tätä prosessia säädellään ja ohjataan sarjan signaalinsiirtoreittejä, mukaan lukien cAMP-Ca2 plusja niin edelleen.
Lyhyesti sanottuna GLP:n{0}} biosynteesi sisältää useiden linkkien ja tekijöiden yhteistoiminnan. Biosynteesin ja kemiallisen synteesin yhdistelmä voi tarjota paremman perustan ja tuen GLP:n tutkimukselle ja tuotannolle-1.
Menetelmä viisi, entsymaattinen synteesi:
Entsymaattinen synteesi on peptidiketjujen synteesi biologisten entsyymien katalyysin kautta. Verrattuna perinteisiin nestefaasisynteesimenetelmiin, entsymaattinen synteesi voidaan suorittaa huoneenlämpötilassa ja valita laaja valikoima raaka-aineita. Entsyymejä, kuten theta-neste-syntaasi, AEP, ACE jne., käytetään yleensä katalysoimaan synteesiä.
Yhteenvetona voidaan todeta, että edellä mainitut menetelmät ovat käyttökelpoisia menetelmiä GLP{1}}-synteesiin. Erilaiset menetelmät sopivat erilaisiin koeolosuhteisiin ja lääketuotantoympäristöihin.