IPTGon luonnoton yhdiste, jossa on isopropyyli- ja galaktoosiryhmä. Sen molekyylikaava on C9H18O5S, jonka suhteellinen molekyylipaino on 238,30. IPTG liukenee veteen ja sillä on korkea stabiilisuus. Biologiassa IPTG:tä käytetään pääasiassa indusoijana ja se voi indusoida - Galaktosidaasin aktiivisuutta. IPTG (isopropyyli) - D-tiogalaktosidi on yleisesti käytetty laboratorioreagenssi, jota käytetään laajalti molekyylibiologian ja geenitekniikan aloilla. Se on keinotekoisesti syntetisoitu yhdiste, jonka rakenne muistuttaa luonnollista laktoosia, mutta jolla on erilaiset kemialliset ominaisuudet.
(Tuotelinkki 1:https://www.bloomtechz.com/synteettinen-kemiallinen/api-researching-only/iptg-reagenssi-cas-367-93-1.html )
(Tuotelinkki 1:https://www.bloomtechz.com/synteettinen-kemiallinen/api-researching-only/iptg-powder-cas-367-93-1.html )
1. Molekyylirakenne:
IPTG:n kemiallinen kaava on C9H18O5S, CAS 367-93-1 ja suhteellinen molekyylipaino on 238,30 g/mol. Sen rakenne on liitetty isopropyyliryhmällä - D-tiogalaktosidin C1-asema muodostaa esterisidoksen. Tämän rakenteen ansiosta IPTG voi simuloida laktoosin induktiovaikutusta laktaasiin.
Sen molekyylirakenne koostuu pääasiassa seuraavista osista:
Sokeriosa: IPTG:n sokeriosa on - D-galaktoosi, joka on samanlainen kuin tiogalaktoosi, jonka myös Escherichia colin galaktosidaasi tunnistaa.
Tiogalaktosyyliosa: Toisin kuin tavallinen galaktoosi, IPTG:n galaktosyyliosa korvataan rikkiatomeilla, mikä mahdollistaa IPTG:n kemiallisen modifioinnin E. colilla - Galaktosidaasi tunnistaa ja toimii sen substraattina.
Isopropyyliryhmä: Toinen IPTG:n osa on isopropyyliryhmä, joka vähentää IPTG:n liukoisuutta veteen ja helpottaa sen läpäisyä soluviljelmässä.
Molekyylirakenteen suhteen IPTG:n ja galaktosidaasi-D-galaktosidin (G1P) substraatti on samanlainen, paitsi että galaktosidiosaan on lisätty rikkiatomi. Kun solut ottavat IPTG:tä vastaan, se voi toimia - Galaktosidaasin substraattina, joka pilkkoutuu tiogalaktoosi- ja isopropyyliryhmiksi entsyymin - - D-glukoosi vaikutuksesta. Tämän prosessin vapauttamaa energiaa voidaan käyttää ilmentyneiden vieraiden proteiinien syntetisoimiseen.
Molekyylirakenteen ominaisuuksien lisäksi IPTG:llä on myös useita etuja, jotka tekevät siitä yleisesti käytetyn indusoijan. Ensinnäkin sen vesiliukoisuus on suhteellisen hyvä ja se voidaan helposti lisätä elatusaineeseen. Toiseksi sen indusoiva vaikutus Escherichia coliin on suhteellisen lievä eikä aiheuta liikaa painetta soluihin, mikä on hyödyllistä solujen eliniän pidentämisessä. Lisäksi IPTG:n otto ja hyödyntäminen soluissa on suhteellisen nopeaa, mikä voi laukaista geeniekspression oikea-aikaisesti.
2. Liukoisuus:
IPTG on väritön kiteinen kiinteä aine, joka liukenee hyvin veteen. Se voi liueta nopeasti huoneenlämpötilassa ja muodostaa läpinäkyvän liuoksen. Lisäksi IPTG liukenee myös joihinkin orgaanisiin liuottimiin, kuten metanoliin, etanoliin ja dimetyylisulfoksidiin.
3. Vakaus:
IPTG on suhteellisen stabiili tavanomaisissa koeolosuhteissa, eikä se ole altis hajoamiselle tai hajoamiselle. Sitä voidaan säilyttää pitkään menettämättä aktiivisuuttaan. Korkeassa lämpötilassa tai happamissa olosuhteissa IPTG voi kuitenkin käydä läpi hydrolyysireaktioita, jolloin se menettää kykynsä indusoida laktaasia.
4. Laktaasin indusoiminen:
IPTG on tehokas laktaasin indusoija. Useimmissa Escherichia colissa laktaasi on tärkeä metabolinen entsyymi, jota käytetään pilkkomaan laktoosi glukoosiksi ja galaktoosiksi. IPTG:llä on samanlainen rakenne kuin laktoosilla ja se voi sitoutua laktaasin induktiokohtaan ja aktivoida sen transkription. Tämä tekee IPTG:stä tärkeän työkalun geeniekspression säätelyn ja proteiinin ilmentymisen tutkimiseen.
Bakteereissa laktoosioperonit ovat tärkeä säätelyjärjestelmä, joka voi säädellä bakteerien laktoosin aineenvaihduntaa. Kun bakteerisoluista puuttuu glukoosia, laktoosioperonit indusoituvat syntetisoimaan entsyymejä, jotka pystyvät hajottamaan laktoosia.
Laktoosioperonien koostumus: Laktoosioperoni koostuu kolmesta geenistä, nimittäin lacZ, lacY ja lacA. Niistä lacZ:ta koodaava - galaktosidaasia, lacY koodaa permeabiliteettiproteiinia, lacA koodaa asetyylitransferaasia. Nämä kolme geeniä toimivat yhdessä, jotta bakteerit voivat hyödyntää laktoosia.
IPTG:n vaikutusmekanismi: Kun IPTG on olemassa, se voi olla vuorovaikutuksessa - Galaktosidaasin sitoutuminen tehostaa entsyymiaktiivisuutta. Tämä sitoutuminen saavutetaan IPTG-molekyylin galaktoosiryhmän ja - Galaktosidaasin aktiivisen keskuksen sitoutumisen kautta. Tämä sitoutuminen lisää entsyymin aktiivisuutta ja edistää siten laktoosin hajoamista.
Induktioprosessi: Ympäristössä, jossa ei ole glukoosia, syntetisoidaan lacY- ja lacA-geenejä, mutta synteesin määrä on suhteellisen pieni. Kun IPTG on olemassa, se voi olla vuorovaikutuksessa - Galaktosidaasin sitoutuminen lisää entsyymiaktiivisuutta. Tämä sitoutuminen stimuloi lacY- ja lacA-geenien transkriptiota, jolloin bakteerit voivat syntetisoida suuren määrän läpäisevyysproteiineja ja asetyylitransferaaseja. Nämä entsyymit voivat edistää bakteerien laktoosin aineenvaihduntaa.
Vaikuttavat tekijät: IPTG:n pitoisuus vaikuttaa induktiovaikutukseen. Pieni IPTG-pitoisuus voi edistää - Galaktosidaasin synteesiä, mutta suurilla IPTG-pitoisuuksilla voi olla myrkyllisiä vaikutuksia soluihin. Lisäksi IPTG:n induktiovaikutukseen vaikuttavat myös sellaiset tekijät kuin lämpötila, pH-arvo ja viljelyaika.
5. Ei myrkyllisyys:
Laktoosiin verrattuna IPTG:n aineenvaihdunta soluissa on hitaampaa, joten sillä on vähemmän vaikutusta solujen kasvuun ja aineenvaihduntaan. Tämä tekee IPTG:stä yleisesti käytetyn indusoijan laboratoriossa kohdegeenien ilmentymisen säätelemiseksi.
6. Sovellus:
IPTG:tä käytetään pääasiassa seuraavissa asioissa:
- Proteiinin ilmentyminen: Käyttämällä IPTG-indusoijia kohdeproteiinien saantoa rekombinanttiproteiinin ilmentämisjärjestelmässä voidaan kontrolloida. Sitä voidaan käyttää tutkimaan biologisia prosesseja, kuten proteiinien toimintaa, vuorovaikutusta ja signaalinsiirtoa. Esimerkiksi proteiinien kiteytyskokeiden avulla voidaan tutkia proteiinien rakennetta ja toimintaa; Proteiinien vuorovaikutuskokeiden avulla voidaan tutkia proteiinien välistä vuorovaikutusta; Signaalinvälityskokeiden avulla voidaan tutkia proteiinien roolia signaalinsiirrossa.
-Geenisäätelytutkimus: IPTG voi simuloida laktoosin induktiomekanismia soluissa ja tutkia siten geenisäätelyverkostoja ja signaalinvälitysreittejä. Geeniekspression säätelykokeissa IPTG toimii indusoijana ja voi sitoutua lac |:iin tuotteet laktoosioperoneissa, aiheuttaen konformaatiomuutoksia ja aiheuttaen lac|tuotteet poistumaan promoottorin sitoutumiskohdasta aktivoiden siten transkription. Tämä indusoituva transkription säätelymekanismi tekee IPTG:stä tärkeän roolin geeniekspression säätelyssä. Säätelemällä IPTG:n lisäysaikaa ja pitoisuutta voidaan saavuttaa kohdeproteiinin ilmentymisen säätely.
-Transkriptiotekijätutkimus: IPTG:llä voidaan tutkia transkriptiotekijöiden ja niiden kohdegeenien välistä vuorovaikutusta sekä transkriptiotekijöiden toiminnallisia säätelymekanismeja. Yhdistämällä laktaasin replikaattoriin IPTG voi simuloida laktoosin säätelyprosessia laktaasin suhteen ja siten kontrolloida geenin ilmentymistä. Tätä induktiomekanismia voidaan soveltaa transkriptiotekijätutkimukseen transkriptiotekijöiden säätelevän roolin tutkimiseksi spesifisessä geenitranskriptiossa. Esimerkiksi ekspressiovektori, joka sisältää kohteena olevan transkriptiotekijän, voidaan rakentaa ja integroida sopivien promoottoreiden ja säätelyelementtien kanssa ilmentämisvektoriin, mitä seuraa IPTG:n lisääminen kohteena olevan transkriptiotekijän ilmentymisen indusoimiseksi.
IPTG on yleisesti käytetty laboratorioreagenssi, jolla on hyvä liukoisuus ja stabiilisuus. Se voi indusoida laktaasin ilmentymistä ja sitä käytetään laajalti molekyylibiologian ja geenitekniikan aloilla. IPTG:tä käyttämällä tutkijat voivat tutkia tärkeitä biologisia kysymyksiä, kuten geenin säätelymekanismeja, proteiinien ilmentymistä ja transkriptiotekijän toimintaa.